El Informe de la Misión Civil de Observación del Tren Maya, elaborado por organizaciones indígenas, ambientales y de derechos humanos, documentó afectaciones directas en los tramos 5, 6 y 7, localizados en Quintana Roo, Yucatán y Campeche. Entre los hallazgos más relevantes se encuentran la fragmentación del territorio, la pérdida de conectividad ecológica, la deforestación masiva y la destrucción de hábitats clave, de manera específica, se acreditaron daños severos a sistemas de cuevas y cenotes, considerados esenciales para el equilibrio hidrológico de la península, así como modificaciones en los flujos subterráneos de agua dulce y riesgos de contaminación asociados a la introducción de materiales ajenos al entorno natural

Uno de los datos más alarmantes documentados en el Tramo 5 es la afectación directa a al menos 125 cuevas y cenotes, muchos de ellos fragmentados o en riesgo de colapso. La Misión Civil constató que se perforó el suelo kárstico para instalar más de 15 mil pilares de acero y concreto, los cuales fueron anclados en cavidades naturales de hasta 40 metros de profundidad. Esta intervención alteró la estructura del subsuelo, incrementó la vulnerabilidad a derrumbes y modificó la circulación natural del agua, con impactos que se extienden a la flora, la fauna y las comunidades humanas que dependen de estos sistemas subterráneos para su abastecimiento y equilibrio ambiental

El informe también señala que las autoridades ambientales federales omitieron realizar estudios propios de calidad del agua y evaluaciones técnicas detalladas sobre cenotes, cavernas y acuíferos, limitándose a Manifestaciones de Impacto Ambiental que no contemplaron de forma específica estos ecosistemas. A la par, se documentaron violaciones sistemáticas al derecho a la consulta previa, libre e informada de las comunidades mayas, así como un contexto de militarización, represión y control territorial ejercido por fuerzas federales durante la construcción del proyecto. Estas condiciones facilitaron la aceleración del cambio de uso de suelo, la expansión de desarrollos turísticos y procesos de especulación inmobiliaria en zonas colindantes a la vía férrea

El Tribunal Internacional por los Derechos de la Naturaleza respaldó públicamente las conclusiones del informe y reiteró que el Tren Maya constituye un caso documentado de ecocidio y etnocidio, señalando la responsabilidad del Estado mexicano por la violación de los Derechos de la Naturaleza y de los derechos bioculturales del pueblo maya. En una resolución actualizada emitida en Septiembre, el Tribunal declaró a los cenotes como sujetos de derechos, exigió la suspensión del proyecto, la desmilitarización de los territorios indígenas y la reparación integral de los ecosistemas dañados, sin que hasta la fecha exista una respuesta oficial por parte del Gobierno federal a estas determinaciones.